上海酶聯生物ELISA實驗操作注意事項及常見問題解答

一、ELISA操作前準備工作 試劑盒的選擇 ELISA操作前，應做好實驗的設計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒、提前訂購和準備試劑及耗材、處理樣本等準備工作。 樣本處理 在收集標本前需有一個完整的計劃，需要清楚要檢測的成份是否足夠穩定。ELISA檢測提倡新鮮標本盡早檢測，對收集后當天就進行檢測的標本，及時儲存在4℃備用，如有特殊原因需要周期收集標本，請取材后，將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實驗質量，所以避免反復凍融。 二、常見問題 1、ELISA試驗出現非常弱的結果，常見有7種原因，其解決方法如下： 1)可能原因：溫育的時間或者溫度不夠； 解決方法：校正溫育箱溫度。 2)可能原因：顯色反應時間太短； 解決方法：校正定時鐘準確定時。 3)可能原因：所用配制緩沖液的蒸餾水有問題； 解決方法：使用新鮮合格的蒸餾水。 4)可能原因：加入抗體/酶的稀釋液濃度太低； 解決方法：按照說明書保存試劑盒和準確配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密。 5)可能原因：酶標儀濾光片不正確； 解決方法：檢查酶標儀使用的濾光片。 6)可能原因：試劑盒沒有充分平衡； 解決方法：試劑室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫。 三、ELISA標準品溶解 標準品是試劑盒的檢測抗原的一個度量標尺，因此標準品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細節：凍干標準品溶解按照說明書的要求，準確復溶。在冰上操作標準品為佳，靜止5－10分鐘，輕輕搖勻后按照一次量分裝，在-20度或-70度保存。標準品嚴禁反復凍融。標準品的倍比稀釋應事先做好準備，如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備；稀釋時，應充分混勻；采用進口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實驗孔內進行倍比稀釋時，注意操作規范，槍頭勿刮劃預包被的孔底。 四、ELISA操作中的洗滌 洗滌是ELISA實驗中是最多次數的操作，也是非常重要的步驟。不嚴格的洗滌容易出現洗不干凈或交叉污染現象，實驗重復效果差的現象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機，嚴格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數。注意標準化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。操作者常出現洗板不干凈現象，請比照“手工洗板小貼士"操作： a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會增高。 b)特別注意：設計實驗的時候要考慮實驗孔的位置，保證甩掉洗液時，空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側或分開最好。同時注意甩掉洗液的動作翻轉（從正上方旋轉120－150度）要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉來甩液體！甩出后以直線方式補2－3次甩出液體。 c)用干凈的濾紙，不要用衛生紙，因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導致洗板不干凈，結果偏高或偏低，重復孔的數值也會相差很大。 d)每次拍板不要重復在一個地方拍，特別是洗去酶的步驟；拍板不宜過輕，否則拍不干凈，拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重，以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，最后一次一定要扣干凈。 e)不能減少洗液體積、洗板時間和次數。洗板時間太短，洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數可以使背景更干凈。 五、ELISA的標準曲線如何擬合？ 一般情況按照說明書推薦方法擬合標準曲線。標準曲線可以由酶標儀附帶軟件自動生成，也可手動制作。標準曲線呈“S"形曲線，兩端趨于水平，中間趨于線性，中間部分為較佳的檢測范圍。當標準品的量超過與包被抗體結合的量，此時標準品已飽和，再增加標準品的量，其OD值不再變化，故當標準品達到一定濃度后，曲線就趨于水平。一般廠商給出的濃度范圍落在中間線性范圍，根據標準曲線，可以測出樣本的濃度。按照科學分析方法，如果存在“奇異點"或者“污點"，直接采用線性分析不是很好，要對擬合標準曲線的幾個點進行取舍，同時也可改用雙對數直線擬合或者四因素曲線擬合。 上海酶聯生物科技有限公司有詳細大量關于試劑盒相關產品說明書，購買ELISA試劑盒還可以享受免費代測服務您只需要把標本寄給我們，一星期左右就可以出實驗數據。<o:p></o:p>

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