細(xì)胞冷凍保存的具體操作步驟

細(xì)胞冷凍保留的具體操作過(guò)程<o:p></o:p> 依據(jù)技術(shù)部給出的最新細(xì)胞冷凍保留辦法，現(xiàn)公布于下：<o:p></o:p> 1. 注意事項(xiàng)：<o:p></o:p> 1.1. 欲冷凍保留之細(xì)胞應(yīng)在成長(zhǎng)杰出(log phase) 且存活率高之狀況，約為80 – 90 %致密度。<o:p></o:p> 1.2. 冷凍前檢查細(xì)胞是不是仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保留前一至二日測(cè)驗(yàn)是不是有抗體之發(fā)生。<o:p></o:p> 1.3. 留意冷凍保護(hù)劑之質(zhì)量。DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色(以0.22 micronFGLP Telflon 過(guò)濾或是直接購(gòu)買無(wú)菌商品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保留，勿作多次凍結(jié)。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保留。在敞開(kāi)后一年內(nèi)運(yùn)用，因長(zhǎng)時(shí)間貯存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。 1.4. 冷凍保留之細(xì)胞濃度：<o:p></o:p> 1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會(huì)因冷凍濃度太高而在凍結(jié)24 小時(shí)后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細(xì)胞品種而異。Adenocarcinoma 凍結(jié)后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須最少5 x 106cells/ml。<o:p></o:p> 1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 % DMSO，如果不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保留之一起，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以避免冷凍失利。<o:p></o:p> 1.6. 冷凍辦法： 1.6.1. 傳統(tǒng)辦法: 4℃ 10 分鐘---> -20℃ 30 分鐘---> -80℃ 16 - 18 小時(shí)(或過(guò)夜) ---> 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)時(shí)間貯存。 1.6.2. 程序降溫：運(yùn)用等速降溫機(jī)以–1 ～ -3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃，放在液氮槽vapor phase 長(zhǎng)時(shí)間貯存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保留。<o:p></o:p> 細(xì)胞冷凍保留<o:p></o:p> 2. 資料： 2.1. 成長(zhǎng)杰出之培育細(xì)胞 2.2. 新鮮培育基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無(wú)菌塑料冷凍保留管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)<o:p></o:p> 3. 過(guò)程： 3.1. 冷凍前一日前替換半量或全量培育基，調(diào)查細(xì)胞成長(zhǎng)景象。 3.2. 制造冷凍保留溶液(運(yùn)用前制造)：將DMSO 參加新鮮培育基中，最終濃度為5-10%，混合均勻，置于室溫下待用。 3.3. 依細(xì)胞繼代培育之操作，搜集培育之細(xì)胞，取少數(shù)細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。<o:p></o:p> 3.4. 離心，去掉上清液，參加適量冷凍保留溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)明徹底之冷凍保留管中，1 ml/vial，并取少數(shù)細(xì)胞懸浮液作污染檢查。 3.5. 冷凍保留辦法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16～18 小時(shí)(或過(guò)夜) → 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)時(shí)間貯存。 3.6. 冷凍保留辦法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。<o:p></o:p> 十二月新品優(yōu)惠中，期待來(lái)電咨詢訂貨！<o:p></o:p>

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