一文細(xì)說酶偶聯(lián)抗體及其作用

<div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)抗原、<a href="/category-23-b0.html">酶標(biāo)抗體</a>、酶標(biāo)SPA等。酶標(biāo)記物的質(zhì)量直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功，被稱為關(guān)鍵試劑。最常用的酶標(biāo)記物是酶標(biāo)抗體，它是將酶和特異性抗體通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄟB接而成。酶標(biāo)抗體的質(zhì)量，主要取決于酶和抗體的純度好、活性強(qiáng)、親和力高，其次取決于良好的制備方法。制備方法宜選擇產(chǎn)率高，不影響結(jié)合物活性，不混入干擾物質(zhì)，簡單易操作的方法。</span></div> <div style="text-align: center;"><span style="font-size: 12px;"><img src="/images/upload/Image/圖 1_ 抗體-酶結(jié)合方法示意圖。(Ozkan B等人；2019).jpg" alt="抗體-酶結(jié)合方法示意圖" width="500" height="126" /><br /> </span></div> <div style="text-align: center;">&nbsp;</div> <div style="text-align: center;">圖1&nbsp;圖 1. 抗體-酶結(jié)合方法示意圖。(Ozkan B等人；2019)</div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 酶制劑及其底物</span></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 原則上，任何無毒、能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶均可作為標(biāo)記物。但用作標(biāo)記抗體的酶應(yīng)滿足以下要求：</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; （1）來源方便，易于純化；</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; （2）比活高，性質(zhì)穩(wěn)定；</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; （3）酶活力和酶量測定方法簡便。免疫酶技術(shù)中常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP），其次是葡萄糖氧化酶、&beta;-半乳糖苷酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶等。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 辣根過氧化物酶（HRP）因其比活高、穩(wěn)定性好、分子量小、純酶易制備等特點(diǎn)，是最常用的酶。HRP廣泛分布于植物界，在辣根中含量較高。它是由無色酶蛋白和棕色鐵卟啉組成的糖蛋白，含糖量為18%。HRP由多個(gè)同工酶組成，分子量為40000，等電點(diǎn)為PH3~9。酶催化的最適pH值因供氫體不同而略有不同，但大多在PH5左右。該酶可溶于水和飽和度小于58%的硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白的最大吸收光譜分別為403nm和275nm。酶的純度一般用OD403nm/OD275nm的比值RZ（德國萊茵蘭-普法爾茨法）表示。高純度酶的RZ值應(yīng)在3.0左右（最高可達(dá)3.4）。RZ值越小，非酶蛋白含量越高。需要注意的是，純度并不代表酶活性。例如，當(dāng)酶變性時(shí)，RZ值可能保持不變。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫（H2O2）和氫供體（DH2）。氫供體多為無色還原染料，反應(yīng)可生成有色氧化染料（D）。氫供體的種類繁多，形成的產(chǎn)物特性各異。例如，DAB（3,3-二氨基聯(lián)苯胺）的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀，且具有電子密度，適合用于免疫酶染色或電鏡觀察。5AS（5-氨基水楊酸）早期用于ELISA，但其溶解度不夠高，空白孔難以控制無色，現(xiàn)已很少使用。OT（鄰甲苯胺）的特點(diǎn)是能生成鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物，靈敏度高，但反應(yīng)受溫度影響較大，且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)測定。目前應(yīng)用較為廣泛且較為滿意的氫供體有：OPD（鄰苯二胺）和TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。前者生成的產(chǎn)物為深橙色或棕色，后者的產(chǎn)物為藍(lán)綠色。二者溶解性均較好，在暗處顯色穩(wěn)定，空白可接近無色。據(jù)報(bào)道，后者的靈敏度可比前者提高4倍。此外，還有一種氫供體ABTS（2,2'-邊氮-雙(3-乙基苯并硫代吡咯烷-6磺酸)），其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，靈敏度和穩(wěn)定性均較好。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 由于HRP的底物H2O2本身是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2用量不能過量，應(yīng)控制在較短的反應(yīng)時(shí)間后，顏色達(dá)到峰值（表明H2O2已耗盡）。這樣，即使延長時(shí)間，反應(yīng)產(chǎn)物的顏色也不會(huì)加深。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 如何標(biāo)記抗體</span></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 酶與抗體的交聯(lián)方法有很多種，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)可采用不同的方法。對于HRP偶聯(lián)物的制備，可采用戊二醛兩步法和高碘酸鈉法。其中，較為常用的是簡單的高碘酸鈉法。</span></div> <p>&nbsp;</p>