ELISA 基本原理及步驟

<p>&nbsp;<span style="font-size: 12px;"> &nbsp; &nbsp;ELISA技術(shù)于20世紀(jì)70年代初由荷蘭學(xué)者VanWeeman和Schurrs與瑞典學(xué)者Engvall和Perlman幾乎同時提出。最初，ELISA主要用于病毒、細(xì)菌的檢測。20世紀(jì)70年代末，它開始廣泛應(yīng)用于抗原、抗體的定性和定量測定，包括一些藥物、激素、毒素等半抗原分子的定量檢測。由于ELISA檢測對儀器要求低，操作簡便，特別是樣品前處理簡單，易于推廣，且具有準(zhǔn)確、靈敏、快速、特異、經(jīng)濟等優(yōu)點，日益成為眾多領(lǐng)域分析技術(shù)研究的熱點。</span></p> <p style="text-align: center;"><span style="font-size: 12px;"><img src="/images/upload/Image/微信圖片_20250331164136.jpg" alt="酶聯(lián)生物ELISA試劑盒" width="500" height="375" /></span></p> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp;</span><strong><span style="font-size: 12px;"> ELISA原理</span></strong></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相吸附和酶標(biāo)記。固相載體表面的抗原或抗體仍然保留其免疫活性，而酶標(biāo)記的抗原或抗體則同時保留了其免疫活性和酶的活性。測定時，待測標(biāo)本（即其中所含的待測抗體）與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。通過洗滌，固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物可以與液體中的其他物質(zhì)分離，然后加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，該抗原或抗體也通過反應(yīng)結(jié)合到固相載體上。此時，固相上的酶量與標(biāo)本中待測物的含量成一定比例。加入酶反應(yīng)底物后，底物在酶的催化下生成有色產(chǎn)物。產(chǎn)物的量與標(biāo)本中待測物的含量直接相關(guān)，因此可以根據(jù)顏色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率高，間接放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使檢測方法更加靈敏。可根據(jù)試劑來源、標(biāo)本情況和檢測的具體條件，設(shè)計不同類型的檢測方法。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA實驗技巧</span></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 1.加樣</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA中最常見的操作是加樣，涉及到每個步驟。目前一般使用移液槍加樣，將規(guī)定的量加入到板孔中。加樣時，首先要注意將加入的物質(zhì)加入到板孔底部，避免加入到孔壁的上部，并且不要噴濺或產(chǎn)生氣泡。加入不同物質(zhì)時應(yīng)更換噴嘴，避免交叉污染。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 另外，顯色時最好使用多通道移液槍快速完成加液過程，因為顯色對時間要求較高，最好同時顯色，加液時間越均勻，結(jié)果誤差越小。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 2.稀釋</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA實驗中，準(zhǔn)確的稀釋操作非常重要。為了獲得可靠的結(jié)果，應(yīng)該使用同一型號的微量移液器和吸頭，并在試管或其他合適的容器中進行稀釋，確保混合均勻后，再將稀釋后的液體加入到板孔中。避免在板孔中直接稀釋，以減少誤差和交叉污染的風(fēng)險。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 3.洗滌</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 在ELISA過程中，洗滌雖然不是反應(yīng)步驟，但也決定了實驗的成敗。ELISA依靠洗滌來分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記，去除殘留在板孔中的未與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及反應(yīng)過程中非特異性吸附到固相載體上的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍存在的，這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)應(yīng)在洗滌過程中洗掉。可以說，在ELISA操作中，洗滌是最重要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視。操作者應(yīng)嚴(yán)格按照要求進行洗滌，掌握洗滌技術(shù)，確保洗滌液充滿每個孔。洗板后，最好在吸水紙上輕輕拍干（選擇干凈、無塵或少吸塵的材質(zhì)），并嚴(yán)格遵守洗滌時間。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 4.顯色</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 顯色是ELISA反應(yīng)的最后一步，酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物。反應(yīng)溫度和時間也是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可以保持無色，而陽性孔則隨著時間的推移顏色逐漸加深。適當(dāng)提高溫度有助于加快顯色。定量測定時，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)盡可能準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫下進行，時間一般無需嚴(yán)格控制。有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況，適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，并及時判斷。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 5.數(shù)據(jù)讀取</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 比色前應(yīng)先用干凈的吸水紙吸干酶標(biāo)板底部附著的液體，以減少對比色的干擾，然后將酶標(biāo)板正確放入酶標(biāo)儀的比色架上。酶標(biāo)儀應(yīng)放置在避光環(huán)境中，操作溫度為15～30℃。使用前應(yīng)將酶標(biāo)儀預(yù)熱15～30分鐘，以使結(jié)果更穩(wěn)定。</span></div>