細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離

細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和巨細(xì)都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，依據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)別離出來(lái)。<o:p></o:p> 別離細(xì)胞器最常用的辦法是將安排制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行別離，其過(guò)程包含安排細(xì)胞勻漿、分級(jí)別離和剖析三步，這種辦法已成為研討亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功用的主要手法。<o:p></o:p> 勻漿（Homogenization）低溫條件下，將安排放在勻漿器中，參加等滲勻漿介質(zhì)（即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣）進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。<o:p></o:p> 分級(jí)別離（Fractionation）由低速到高速離心逐步沉降。先用低速使較大的顆粒沉積，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉積下來(lái)，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以別離。<o:p></o:p> 因?yàn)闃悠分懈鞣N巨細(xì)和密度不同的顆粒在離心開始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級(jí)離心得到的第一次沈淀必定不是純的最重的顆粒，須經(jīng)重復(fù)懸浮和離心加以純化。<o:p></o:p> 剖析  分級(jí)別離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化辦法進(jìn)行形態(tài)和功用判定。<o:p></o:p> 細(xì)胞核的別離提取<o:p></o:p> （一）操作過(guò)程<o:p></o:p> 1．用頸椎脫位的辦法處死小白鼠后，敏捷剖開腹部取出肝臟，剪成小塊（去除結(jié)締安排）盡快置于盛有0.9％NaCl的燒杯中，重復(fù)洗滌，盡量除掉血污，用濾紙吸去外表的液體。<o:p></o:p> 2．將濕重約1g的肝安排放在小平皿中，用量筒量取8ml預(yù)冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝安排后，再悉數(shù)參加。<o:p></o:p> 3．剪碎的肝安排倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿筆直插入管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨3～5次，用3層紗布過(guò)濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好符號(hào)，天然枯燥。<o:p></o:p> 4．將裝有濾液的離心管配平后，放入一般離心機(jī)，以2500rpm，離心15分鐘；（1）慢慢取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待別離線粒體用；（2）同時(shí)涂一張上清液片②做好符號(hào)，天然枯燥；（3）余下的沉積物進(jìn)行下一過(guò)程。<o:p></o:p> 5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液懸浮沉積物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于潔凈的載玻片上，涂片③，天然枯燥。<o:p></o:p> 6．將①、②、③涂片用l％甲苯胺蘭染色后蓋片即可調(diào)查。<o:p></o:p> （二）成果<o:p></o:p> 別離于高倍鏡下調(diào)查三張涂片，描述鏡下所見。<o:p></o:p> 高速離心別離提取線粒體<o:p></o:p> （一）操作過(guò)程<o:p></o:p> 1．將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm離心20分鐘，棄上清，留取沉積物。<o:p></o:p> 2．參加0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉積物，參加0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液混勻成懸液（可用牙簽）。<o:p></o:p> 3．取上清液和沉積物懸液，別離滴一滴于潔凈載玻片上（別離符號(hào)④、⑤涂片），各滴一滴0.02％詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20分鐘。<o:p></o:p> （二）成果<o:p></o:p> 油鏡下調(diào)查，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍(lán)綠色。<o:p></o:p>

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細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離